HSP58信息
编码运动蛋白KIF1C的基因中的双等位基因功能缺失突变与遗传性痉挛性截瘫（HSP）SPG58型有关，这是一种缓慢进行性的神经退行性运动神经元疾病。KIF1C的生物学作用尚未完全了解。我们使用了基于蛋白质的CRISPR/Cas9基因组编辑方法，从健康对照中生成了纯合KIF1C基因敲除iPSC系（HIHRSi-A-1）。该iPSC-KIF1C-/-品系和相应的等基因对照是研究KIF1C的生理功能以及KIF1C功能障碍在人类疾病中的病理生理后果的有用模型。
1。资源实用程序编码微管依赖性运动蛋白KIF1C的基因中的功能丧失突变与遗传性痉挛性截瘫有关（CaballeroOteyzaetal。，）。功能性KIF1C敲除iPSC的产生和相应的等基因控制将允许研究KIF1C的生物学功能和疾病相关细胞类型中KIF1C缺乏的发病机理。
2。资源详细信息使用表达人OCT4，KLF4的游离质粒对来自健康24岁女性供体的人皮肤成纤维细胞进行重编程。L-MYC（OSKM），SOX2和LIN28（Okita等人，年）并扩展了几个段落。
然后使用基于蛋白质的CRISPR/Cas9基因组编辑方法，将所得的iPSC（HIHRSi-A（iPSC-CO））用于产生纯合的KIF1C敲除品系（资源表）。首先，用两个靶向KIF1C基因外显子2和3的核糖核蛋白（RNP）复合物对iPSC-CO进行核转染。利用荧光标记的tracrRNA（Atto），可以选择通过荧光激活细胞分选（FACS）成功整合RNP复合物的细胞。然后，在单细胞接种后，手动挑取菌落，通过PCR筛选并扩增数代。通过在基因组水平上的Sanger测序验证了CRISPR/Cas9诱导的KIF1C基因第2和第3外显子纯合子71bp缺失的存在（图1一种）。凝胶电泳和蛋白质印迹进一步证实了KIF1C蛋白表达的丧失（图1B）。
资源表。
唯一的干细胞系标识符HIHRSi-A-1干细胞系的替代名称iPSC-KIF1C-/-机构德国神经退行性疾病中心（Hertie）临床大脑科学研究所（DZNE）经销商联系方式丽贝卡·舒勒Rebecca.schuele-freyeruni-tuebingen.de细胞系类型诱导多能干细胞（iPSC）起源人的附加来源信息年龄：24岁性别：女细胞来源成纤维细胞克隆性无性系重新编程的方法非整合型游离质粒基因改造是修改类型CRISPR/Cas9介导的基因敲除相关疾病遗传性痉挛性截瘫SPG58/SPAX2（OMIN＃）基因/基因座NM_.5（KIF1C）;c。[_del]，第[Asp53Alafs*83]修改方法CRISPR/Cas9转基因或抗性的名称不适用诱导/本构系统不适用存档日期/库存日期年十二月细胞系库/库不适用道德认可蒂宾根大学医学院机构审查委员会（Ethikkommission），批准号/B02（/09/30）图1。HIHRSi-A-1的表征和验证。
为了确认iPSC-KIF1C-/-系的基因组完整性，进行了全基因组SNP基因分型（图1C）。此外，通过Sanger测序排除了这两种crRNA的Cas9的前6位潜在潜在脱靶效应（补充图C，补充文件）。iPSC系不含转基因（图1D），不含支原体（补充图A）。此外，其表现出正常的胚胎干细胞样形态（参见表1）。
表1。表征和验证。
分类测试结果数据形态学摄影正常未显示可根据要求提供表型定性分析多能性标志物的免疫细胞化学：SSEA4，TRA1-81，OCT4，碱性磷酸酶染色图1面板F未显示定量分析（RT-qPCR）用于OCT4，NANOG，KLF4，C-Myc，SOX2，DNMT3B和TDGF1的RT-qPCR图1面板E蛋白质表达分析iPSC-KIF1C中没有剩余的KIF1C表达-/-图1面板B基因型使用InfiniumOmniExpressExome-8BeadChip（Illumina）间距（kbp）进行的全基因组SNP基因分型：平均值：3.03；中位数：1,36CRISPR/Cas9介导的基因组编辑后，没有较大的染色体畸变或拷贝数变异图1面板C身分识别STR分析5个站点：F-CO，iPSC-CO和iPSC-KIF1C-/-;所有基因型都匹配与日志一起归档存档变异分析排序c。[_del]，第[Asp53Alafs*83]图1面板A南方印迹或WGS不适用微生物学和病毒学支原体RT-PCR检测支原体，阴性补充图A分化潜能胚状体形成?-微管蛋白（TUJ），平滑肌肌动蛋白（SMA），FOXA2图1面板G捐赠者筛查（可选）HIV1+2乙型肝炎，丙型肝炎不适用基因型附加信息（可选）血型基因分型不适用HLA组织分型不适用多能性通过多能性相关表面标志物（碱性磷酸酶）的表达以及免疫细胞化学证实了干细胞（SSEA-4，TRA1-81和OCT4；图1F）中特征性表达的标志物的蛋白表达来验证。此外，通过RT-qPCR分析了OCT4，NANOG，KLF4，C-MYC，SOX2，DNMT3B和TDGF1的转录表达（图1E）。因此，iPSC-KIF1C-/-系具有与人类胚胎干细胞系（HuES）相似的表达模式，而该表达模式显然不同于成纤维细胞。
为了证实体外产生的iPSC-KIF1C-/-系的多能性，评估了基于胚状体的自发分化为外胚层，中胚层和内胚层细胞谱系，并对相应的标记TUJ，SMA和FOXA2进行了染色（图1G）。）。
3。材料和方法3.1。重新编程和细胞培养将成纤维细胞在含有10％FCS（生命技术）的DMEM高葡萄糖培养基中于37°C/5％CO2下培养。为了进行重新编程，用质粒pCXLE-hUL，pCXLE-hSK和pCXLE-hOCT4（各1μg）对个成纤维细胞进行了核转染（Okita等，）。第二天，向培养基补充2ng/mlFGF2（Peprotech）。在第三天，将培养基更换为含μM丁酸钠的Essential8（E8）培养基，然后每隔一天更换一次。3周后，挑取菌落并扩增。使用具有40％KO-SR（LifeTechnologies），10％DMSO（Sigma-Aldrich）和1μMY-（AbcamBiochemicals）的E8培养基获得冷冻原液。按照制造商的建议使用PCR支原体检测（AppliChem）。
3.2。使用CRISPR/Cas9编辑基因组9×个iPSC-CO细胞用两个预先组装的含Cas9和crRNA-AttotracrRNA的RNP复合物进行核转染（表2）（IntegratedDNATechnologies）。在Atto阳性iPSC的FACS后，接种单细胞，在7-10天后手动挑选集落，然后通过PCR进行筛选。用GeneJET-基因组DNA纯化试剂盒（ThermoFisherScientific）分离了iPSC的DNA。通过使用特定引物的Sanger测序证实纯合缺失的存在（表2）。为了确认KIF1C蛋白的丢失，将细胞在RIPA缓冲液（Sigma-Aldrich）中裂解，并用BCA-ProteinAssayKit（ThermoFisher）测量蛋白浓度。用10％Bis-Tris凝胶和MOPS运行缓冲液（LifeTechnologies）对30μg蛋白进行凝胶电泳后，进行湿转移，并用相应的抗体检测蛋白水平（表2）。
表2。试剂详细信息。
用于免疫细胞化学/流式细胞仪的抗体抗体稀释公司目录号和RRID多能性标记兔抗OCT41：武汉三鹰AB_小鼠抗TRA1-：密理博，AB_小鼠抗SSEA-41：Abcam，AB_体外分化标记鼠标抗SMA1：达科，AB_2223兔抗FoxA21：密理博，AB_鼠标防TUJ1：0SigmaAldrich，AB_蛋白质印迹兔抗KIF1C1：艾博康AB_小鼠抗β-肌动蛋白1：10,西格玛奥德里奇AB_二抗AlexaFluor山羊1：0生活技术抗兔IgGAlexaFluor山羊1：0生活技术抗小鼠IgGAlexaFluor山羊1：0生活技术抗小鼠IgG过氧化物酶缀合1：10,杰克逊免疫研究AffiniPure山羊抗兔过氧化物酶偶联的AffiniPure山羊抗小鼠1：10,杰克逊免疫研究底漆目标正向/反向引物（5-3）附加质粒（PCR）OCT3/4_质粒CATTCAAACTGAGGTAAGGG/TAGCGTAAAAGGAGCAACATAGSOX2_质粒TTCACATGTCCCAGCACTACCAG/TTTGTTTGACAGGAGCGACAATKLF4_质粒CCACCTCGCCTTACACATGAAG/TAGCGTAAAAGGAGCAACATAGL-MYC_质粒GGCTGAGAAGAGGATGGCTAC/TTTGTTTGACAGGAGCGACAATLIN28_质粒AGCCATATGGTAGCCTCATGTCCGC/TAGCGTAAAAGGAGCAACATAG多能性标记（qPCR）10月4日GGAAGGTATTCAGCCAAACG/CTCCAGGTTGCCTCTCACTC二氧化硫AGCTCGCAGACCTACATGAA/CCGGGGAGATACATGCTGATKLF4CCCCAAGATCAAGCAGGAGG/GGGCAGGAAGGATGGGTAATC-MYCATTCTCTGCTCTCCTCGACG/CTGTGAGGAGGTTTGCTGTG纳诺CAAAGGCAAACAACCCACTT/TGCGTCACACCATTGCTATTDNMT3BACGACACAGAGGACACACAT/AAGCCCTTGATCTTTCCCCATDGF1GGTCTGTGCCCCATGACA/AGTTCTGGAGTCCTGGAAGC看家基因（qPCR）GAPDHTCACCAGGGCTGCTTTTAAC/GACAAGCTTCCCGTTCTCAGKIF1CKO的测序KIF1C外显子2-3CGGGTCCTAGGAAGCCAAAAT/CTGTTCCATAATCCTCCGACCCCRISPR指导RNA目标顺序（5-3）核糖核酸KIF1C外显子2TGACCAGTAGGAGTAGTCAAKIF1C外显子3CAGCAAGTGTATCGGGACAT3.3。基因组完整性分析为了排除质粒整合，用质粒特异性引物进行RT-PCR（表2）。通过对5个基因座（供体成纤维细胞，衍生的iPSC-CO，iPSC-KIF1C-/-）的STR分析来进行重编程细胞的亲本谱系。使用Sanger测序分析了每个crRNA的前6个靶标。
使用InfiniumOmniExpressExome-8-BeadChip（Illumina）进行全基因组SNP基因分型，以确认基因组完整性。
3.4。多能性分析多能性标志物的蛋白质表达：使用4％PFA固定细胞，并评估碱性磷酸酶的表达。按照标准方案，用固定的iPSC，特异性抗体（表2）和细胞核染色剂Hoechst33,（1：10.，Invitrogen）进行免疫染色。
多能性标记的转录物表达：提取RNA（高纯度RNA分离试剂盒，Roche）并反转录为cDNA（TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit，Roche）。RT-qPCR使用LightCyclerSYBRGreenIMaster（Roche）一式三份进行。使用2-ΔΔCt方法确定CT值，并将其标准化为GAPDH和参考hESC系HuES-H9。
将iPSC-KIF1C-/-基于胚状体的自发分化为所有三个细菌层：将iPSC接种在EB培养基（80％DMEM/F12（生命技术），20％KO-SR，1×NEAA（Sigma-Aldrich），1×青霉素-链霉素（MerckMillipore），2mM1-谷氨酰胺（Gibco），0.1mMβ-巯基乙醇（Merck））。4天后收集胚胎体，并铺入基质胶包被的平板中以进行外胚层，中胚层和内胚层分化。使用相应的标记TUJ，SMA和FOXA2通过免疫染色验证了分化（表2）。
竞争利益声明作者声明，他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系或个人关系似乎可以影响本文报道的工作。
致谢人胚胎细胞系的cDNA由德国波恩重建神经生物学研究所提供。感谢JenniferReichbauer的出色技术帮助。
这项工作是由德国中心神经退行性疾病的支持（DZNE;资金RS），在德国联邦联邦教育通过对TreatHSP网络（01GM到RS），资金与研究部（BMBF）欧盟展望研究和创新计划下授予编号为的Solve-RD项目（RS）以及美国国立神经系统疾病和中风研究所以及美国国立卫生研究院（No.5R01NS）的协议
该出版物的作者是欧洲罕见神经疾病参考网络–项目ID（RS，LS）的成员。我们感谢DeutscheForschungsgemeinschaft和蒂宾根大学开放获取出版基金会的支持。
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