冷门课题咋发文章看看Nature子刊

这破课题！相信很多小伙伴在拿到课题时都要吐槽这么一句。的确，很有可能导师分给你的课题只是一个idea，参考文献可能连10篇都没有。这种冷门课题有利也有弊，好处是你不用担心被抢发文章，但同时它又是个无缝的蛋，一个突破口都没有，还生怕打碎了。不过凡事没有绝对，小R今天就把这个蛋给煮了，用这篇Nature子刊带大家剥开蛋壳。

壹

Spastin蛋白是与细胞分裂和细胞内囊泡转运有关的微管剪切酶，属于与多种细胞活动有关的ATP酶（AAAProtein）的一种，有证据表明spastin蛋白的缺失与遗传性痉挛性截瘫有关。近日，来自洛克菲勒大学的TarunM.Kapoor课题组利用活性位点突变法筛选并优化合成了spastin的首个选择性抑制剂——spastazoline，并将该结果在线发表在NatureChemicalBiology上，作者也利用spastazoline进一步探究了spastin在细胞分裂过程中的作用。

AAA蛋白家族参与了多种细胞内的活动，包括细胞分裂、细胞器及细胞骨架的产生，这些细胞内活动有一个明显的特征就是其可以在几分钟到几秒内发生，因此如果需要探究细胞的动态机制，开发可以在同样的时间范围内达到抑制效果的该类蛋白的化学探针就显得尤为重要。目前仅有少量的AAA蛋白的化学抑制剂被开发出来，而对于微管剪切酶，尚无选择性和效力明确的抑制剂。

贰

1策略选择

抑制剂开发可以从两方面着手，选择变构位点或者正交位点，但由于人类spastin蛋白的具体结构并不明晰，无法确定其是否具有相应的变构位点，于是作者针对核苷酸结合位点设计相应的抑制剂。但由于该位点较为保守，与配体结合后还会产生变化以及目前尚无与抑制剂结合的AAA蛋白结构数据等条件的限制，开发相应的抑制剂依旧困难重重。

2先导化合物发现

该课题组从已有五种AAA蛋白结构和序列信息出发，发现其核苷酸结合口袋附近的热点区域，突变这些热点区域依旧可以保留果蝇spastin蛋白的ATP酶活性。由于AAA蛋白具有与激酶类似的ATP结合口袋，因此作者对已有的33种激酶抑制剂进行筛选得到能够抑制果蝇spastin蛋白效率为微摩尔级别的化合物1，针对化合物1进行进一步优化得到选择性和效力较强的化合物4，结合对接结果与定点突变的抑制率分析，得到两种可能的构象。

作者分析这有可能是由于该化合物两端分别为苯环和哌嗪环，是化学等价的结构，于是将苯环换成了环丙基，得到化合物5，抑制效率相比于化合物4增强10倍，并且只得到了一种最优的对接结果。

3优化成药

之前的实验主要都是针对果蝇的spastin蛋白进行的，根据人类AAA蛋白的序列分析发现，人类spastin蛋白相较于AAA蛋白家族的其他类型主要的特征结构在于Asn残基，结合化合物5的对接模式发现在与果蝇spastin的Asn位相对应人类spastin蛋白的Asn位在该抑制剂的结合模式中可能起着比较重要的作用，于是作者针对于该基团相互作用的喹啉环进行结构改造，得到了吡咯并嘧啶结构的化合物6，其抑制效率相比于化合物5提高了30倍。

由于该系列化合物的先导化合物是从激酶抑制剂中得来的，可能存在脱靶效应，于是作者测试了化合物6对65种激酶的抑制作用，发现其对其中5种激酶都存在超过50%的抑制效果，通过对接模式分析怀疑是甲基哌嗪环伸入了激酶的疏水口袋，于是在化合物6的基础上将甲基替换成异丙基，阻止了其与激酶的相互作用，得到的化合物7对65种激酶只有一种有明显的抑制效果，降低了其脱靶效应，作者将该化合物命名为spastazoline并作为人源spastin的选择性抑制剂。同时作者也发现NC突变型在保留ATP酶的基础上并不相应该抑制剂的抑制作用。

接着作者通过实验证实了spastazoline可通过抑制spastin蛋白的活性来抑制细胞间桥拆分，从而进一步证实了染色体分裂后期，核被膜的再形成与spastin蛋白的活性及动态定位相关。

叁

可能有些小伙伴在做课题时会存在不容易获得抑制剂-蛋白相互作用的高分辨数据或者构象状态未知的情况，这种基于靶蛋白的活性位点突变的方法可以帮助设计靶标抑制剂。而在抑制剂设计的早期阶段，不容易产生抑制剂的抗性突变时，这种方法也有助于我们找出针对抑制剂的抗性突变。

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